Film, Pers Kralı Xerxes'in devasa ordusuyla Yunanistan'ı işgal etmeye çalışmasıyla başlıyor. Kral Leonidas, 300 Spartalı askeriyle birlikte Thermopylae Geçidi'nde Pers ordusuna karşı durmaya karar veriyor. Leonidas, Pers elçisinin teslim olma teklifini reddediyor ve savaş hazırlıklarına başlıyor. Üç gün süren çatışmalar boyunca, Spartalılar ve onlara katılan diğer Yunan askerleri, Pers ordusuna karşı cesurca direniyor.

Savaşın ilk gününde, Spartalılar dar geçitte Pers ordusunu püskürtüyor. İkinci gün, Persler tekrar saldırıyor ancak yine başarısız oluyorlar. Üçüncü gün, bir Yunan haininin yardımıyla Persler, Spartalıları arkadan kuşatıyor. Leonidas ve askerleri, sonuna kadar savaşmaya karar veriyor ve kahramanca direniyorlar. Sonunda, tüm Spartalılar hayatını kaybediyor ancak gösterdikleri direniş, Yunan şehir devletlerini birleştiriyor ve Perslere karşı daha büyük bir direnişin fitilini ateşliyor.